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Tecnica e qualità

Ecco come vengono analizzati i tuoi esami di laboratorio

Su Il Mio Check-up ti aiutiamo a capire come stai in modo semplice e affidabile. In questa pagina spieghiamo una per una le tecniche di analisi più usate: in modo comprensibile per tutti, ma con approfondimenti per chi cerca maggiori dettagli tecnici.

Kawthar LallamKawthar Lallam · BiotecnologaTesto originale e revisione del contenuto
ELISAECLIAHPLCLC/MSMicroscopiaNGSPCR16S rRNA
Affidabilità

In che modo i laboratori garantiscono l'affidabilità?

Una tecnica di analisi avanzata da sola non basta per ottenere un risultato affidabile. L'affidabilità di un test dipende dall'intera procedura di analisi, dal trattamento del campione alla valutazione del risultato.

I nostri laboratori partner utilizzano metodi convalidati e applicano accreditamento e valutazione esterna della qualità per controllare accuratezza e riproducibilità. Gli accreditamenti e i controlli applicabili variano a seconda del laboratorio partner e del test.

Metodo di analisi Esempi di utilizzo Possibili tipi di campione Caratteristica principale
ELISA Anticorpi, ormoni, proteine Sangue, saliva Legame specifico antigene-anticorpo
ECLIA Valori della tiroide e degli ormoni Sangue Rilevamento immunochimico automatizzato
HPLC Vitamine, piccole molecole Sangue, urina Separazione e quantificazione
LC-MS Ormoni, metaboliti, sostanze tossiche Sangue, urina Elevata specificità analitica
PCR DNA di specifici microrganismi Urina, tampone, feci Rilevamento mirato del DNA
Microscopia Parassiti, lieviti, funghi Feci, materiale per coltura Valutazione visiva da parte di un analista
Sequenziamento Composizione microbica dettagliata Feci Analisi di grandi quantità di materiale genetico

Il metodo di analisi esatto può variare a seconda del test e del laboratorio.

Le tecniche

Otto tecniche di analisi, spiegate in modo chiaro

Dagli immunoassay al sequenziamento del DNA: ecco otto tecniche usate nelle analisi di laboratorio. Il metodo utilizzato dipende dal singolo test e dal laboratorio partner. Leggi la breve spiegazione oppure apri la sezione tecnica per i dettagli.

Test immunologici
01 ELISA

Enzyme-Linked Immunosorbent Assay

In breve

L'ELISA funziona come una ricerca molecolare. Il laboratorio usa proteine speciali (anticorpi) che si adattano perfettamente alla sostanza da misurare, proprio come una chiave in una serratura. Il legame viene trasformato in un segnale cromatico. Nei formati diretti e sandwich, un segnale più intenso indica generalmente una maggiore quantità della sostanza; nel formato competitivo avviene il contrario: più sostanza nel campione significa meno segnale. Il laboratorio interpreta il risultato usando una curva di calibrazione specifica per il metodo. In questo modo il laboratorio misura con precisione ormoni, allergeni o marcatori di infezione.

Applicata, tra l’altro, in questi test:
Test del cortisoloTest di intolleranza alimentare pro
Quattro principi ELISA comunemente utilizzati
Rappresentazione schematica dei quattro formati ELISA più comuni: diretto, indiretto, sandwich e competitivo.Fonte: SouthernBiotech, Introduzione all'ELISA
Leggi l'approfondimento tecnicoNascondi i dettagli tecnici

Un test ELISA si basa su un legame specifico tra un antigene e un anticorpo. Entrambe le molecole si incastrano l’una nell’altra come una chiave in una serratura. Da questo legame nasce una reazione cromatica che può essere misurata: l’intensità del colore viene confrontata con la curva di calibrazione. La relazione dipende dal formato: nel sandwich il segnale aumenta generalmente con la concentrazione, mentre nel competitivo diminuisce. Grazie alla sensibilità del metodo, è possibile rilevare anche piccole quantità.

Esiste una forma qualitativa (la molecola bersaglio è presente?) e una forma quantitativa (in quale concentrazione?). I passaggi dell’ELISA dipendono dal formato: rivestimento e bloccaggio precedono il rilevamento e la lettura del segnale. Durante il rivestimento, l’antigene o l’anticorpo specifico viene legato a una piastra da microtitolazione. Una proteina bloccante occupa poi tutti i siti di legame non specifici. Secondo il formato, l’antigene del campione è adsorbito direttamente sulla piastra oppure catturato da un anticorpo; successivamente si rileva il legame specifico. Un anticorpo marcato con un enzima (spesso HRP o fosfatasi alcalina) trasforma poi un substrato in un prodotto colorato.

Quattro tecniche ELISA

Diretto: L’antigene del campione viene immobilizzato nella piastra e rilevato direttamente con un anticorpo primario marcato con un enzima. Richiede un anticorpo marcato specifico per il bersaglio.

Indiretto: Prima si lega un anticorpo primario (non marcato) all’antigene, poi un anticorpo secondario marcato con un enzima. Utile quando bisogna testare diversi anticorpi primari.

Sandwich: Un anticorpo “capture” cattura la molecola bersaglio; un secondo anticorpo marcato si lega a un altro epitopo e provoca la reazione colorata. È molto usato per misurare gli ormoni come il TSH o l’insulina.

Competitivo: L'antigene presente nel campione compete con un antigene marcato per un numero limitato di siti di legame. In questo caso vale la regola: più alto è il contenuto, più basso è il segnale cromatico. Utilizzato per gli ormoni steroidei come il cortisolo o il testosterone.

Fonti
  • Alhajj, M., Zubair, M., & Farhana, A. (2023). Enzyme linked immunosorbent assay. StatPearls. ncbi.nlm.nih.gov
  • Bio-Rad. Tipi di ELISA: formati diretto, indiretto, sandwich e a competizione.
02 ECLIA

Test immunologico a elettrochemioluminescenza

In breve

ECLIA utilizza la luce come segnale. Quando la sostanza da misurare – ad esempio un ormone – è presente nel tuo sangue, l’anticorpo contenuto nel test si lega ad essa. Una stimolazione elettrica genera un segnale luminoso misurabile. Nel formato sandwich il segnale aumenta generalmente con la concentrazione; nel formato competitivo diminuisce. Per ricavare la concentrazione si usa la curva di calibrazione del metodo. In questo modo è possibile rilevare concentrazioni molto basse.

Applicata, tra l’altro, in questi test:
Test del testosteroneEsami del sangue per la tiroide
Test immunologico competitivo (ECLIA)
Fasi di un test immunologico competitivo (ECLIA).Fonte: ResearchGate, Valutazione analitica dell’ECLIA automatizzato
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ECLIA misura la quantità di una sostanza nel sangue o in altro materiale corporeo, come ormoni o marcatori di infezione. Si verifica una reazione immunologica in cui si crea un legame specifico tra la molecola da misurare e gli anticorpi presenti nel test. Per generare un segnale luminoso si usano anticorpi marcati chimicamente – spesso a base di rutenio – che emettono un lampo di luce quando viene applicata una tensione elettrica. Questo processo si chiama elettrochemiluminescenza.

ECLIA utilizza un formato "sandwich" o "competitivo". In un test "sandwich", due anticorpi si legano alla stessa molecola in punti diversi; questo è particolarmente adatto per biomolecole più grandi come proteine o ormoni. Un test "competitivo" è più indicato per molecole più piccole. Il segnale luminoso misurato viene convertito in un valore di concentrazione: direttamente proporzionale (sandwich) o inversamente proporzionale (competitivo).

I marcatori al rutenio vengono portati allo stato eccitato tramite reazioni redox, emettendo così luce. La tripropilammina (TPA) aggiunta funge da co-reagente per un’eccitazione efficiente. Grazie alla combinazione di rutenio e TPA, il segnale è molto sensibile e stabile, con un ampio intervallo di misurazione lineare fino a livelli picomolari. Questo rende l’ECLIA particolarmente adatta alle piattaforme automatizzate su larga scala che eseguono migliaia di analisi al giorno.

Fonti
  • Blackburn, G. F. et al. (1991). Electrochemiluminescence detection for immunoassays. Clinical Chemistry, 37(9). doi.org
  • Kazerouni, F. et al. (2012). Analytical evaluation of ECLIA for TSH, FT4 and FT3. Caspian J Intern Med, 3(3).
Separazione e spettrometria di massa
03 HPLC

Cromatografia liquida ad alta prestazione

In breve

Immagina un setaccio molto preciso: un liquido contenente diverse sostanze viene spinto ad alta pressione attraverso una colonna. Le sostanze più «appiccicose» rimangono intrappolate più a lungo, mentre altre passano più velocemente. In questo modo tutte le sostanze vengono ordinate una dopo l’altra e il laboratorio può determinare con precisione cosa c’è nel tuo campione e in che quantità.

Applicata, tra l’altro, in questo test:
Esame del sangue: profilo completo
Flusso di lavoro HPLC
Schema di un sistema HPLC: campione → pompa → iniettore → colonna → rivelatore → sistema di acquisizione dati.Fonte: Shimadzu, Panoramica sulla LC
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L'HPLC è una tecnica cromatografica ampiamente utilizzata nelle analisi farmaceutiche, biomediche e alimentari per separare, identificare e quantificare le sostanze presenti in una miscela. La tecnica deriva dalla classica cromatografia su colonna ed è nota per la sua estrema efficienza nella separazione e l’elevata sensibilità di rilevamento.

Un campione liquido viene spinto ad alta pressione (fino a circa 400 atmosfere) attraverso una colonna contenente particelle microscopiche. La capacità di legame di una sostanza dipende da caratteristiche quali polarità, dimensione e affinità per la fase stazionaria. Un sistema tipico comprende una fase stazionaria (colonna impaccata) e una fase mobile liquida che trasporta il campione. I componenti si muovono a velocità diverse ed escono dalla colonna in momenti diversi: questo è il tempo di ritenzione.

Spesso si usa una colonna a fase inversa (RP): una fase stazionaria non polare con una fase mobile relativamente polare, che fa sì che i composti polari eluiscano per primi. Dopo la separazione, un rilevatore converte le concentrazioni in un segnale elettrico e genera un cromatogramma. L’area del picco viene confrontata con una curva di calibrazione, in modo da poter calcolare con precisione la quantità di una sostanza presente. I vantaggi includono tempi di analisi brevi, alta risoluzione e sensibilità.

Fonti
  • Bhardwaj, S. K. et al. (2015). HPLC method development and validation. Int. J. Anal. Bioanal. Chem.
  • Reuhs, B. (2017). High-performance liquid chromatography. In Food analysis, Springer.
04 LC/MS

Cromatografia liquida-spettrometria di massa

In breve

L’LC/MS combina la separazione cromatografica con la misurazione del rapporto massa/carica degli ioni. Il tempo di ritenzione, i segnali selezionati e, quando necessario, la frammentazione MS/MS aiutano a identificare e quantificare le sostanze. Non tutte le molecole sono distinguibili con la sola massa: il laboratorio usa un metodo convalidato e controlli adeguati.

Applicata, tra l’altro, in: analisi ormonali e rilevamento di metaboliti e sostanze tossiche.
Flusso di lavoro LC/MS
Schema di un sistema LC/MS: autocampionatore → colonna LC → sorgente ionica → quadrupolo → rivelatore.Fonte: Pharmacores, Cromatografia liquida-Spettrometria di massa
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L'LC/MS combina la cromatografia liquida (LC), per la separazione delle sostanze, con la spettrometria di massa (MS), che misura il rapporto massa/carica (m/z) degli ioni. I segnali selezionati, il tempo di ritenzione e i controlli del metodo contribuiscono all'identificazione e alla quantificazione.

Durante la LC, il campione viene fatto passare attraverso una colonna; il tempo di ritenzione dipende da proprietà chimiche come la polarità. I componenti eluiti vengono ionizzati nello spettrometro di massa (ad esempio tramite ionizzazione a elettrospray) e analizzati in base al rapporto massa/carica (m/z). Il solo valore m/z non identifica sempre una sostanza senza ambiguità.

Alcuni metodi usano la spettrometria di massa in tandem (MS/MS): un primo analizzatore seleziona lo ione precursore, che in una cella di collisione si frammenta in ioni prodotto, dopodiché un secondo analizzatore ne misura il rapporto m/z. Le transizioni selezionate aiutano a distinguere anche ioni con rapporti m/z simili; identificazione e quantificazione dipendono dal metodo convalidato e dai controlli. La LC/MS è utilizzata in diversi laboratori clinici e diagnostici.

Fonti
  • Fung, A. W. S. et al. (2020). Emerging role of clinical mass spectrometry in pathology. J. Clin. Pathol.
  • Lee, H., & Kim, S. I. (2022). LC-MS-based proteomic analyses of body fluids. Int. J. Mol. Sci., 23(4).
Microscopia
05 Microscopia

Esame al microscopio

In breve

Alcuni campioni vengono esaminati letteralmente al microscopio da un analista esperto. In questo modo, ad esempio, si individuano e si riconoscono parassiti, lieviti e funghi in base alla loro forma e struttura.

Applicata, tra l’altro, in questi test:
Test per i parassiti intestinali
Leggi l'approfondimento tecnicoNascondi i dettagli tecnici

La microscopia viene utilizzata, tra l’altro, nelle indagini parassitologiche e, dopo la coltura, per individuare lieviti e funghi. Per l’analisi, i campioni vengono preparati con metodi di concentrazione (come la sedimentazione o la flottazione) e colorazioni specifiche (ad esempio con iodio o Giemsa). In questo modo, le strutture e gli organismi diventano ben visibili. L’identificazione avviene in base a caratteristiche morfologiche quali forma, dimensioni, struttura della parete e strutture interne.

La microscopia è un metodo relativamente semplice e diretto che fornisce informazioni preziose, ma richiede la competenza di un analista poiché l’interpretazione può essere soggettiva. Per questo motivo, oggi la microscopia viene spesso abbinata a tecniche complementari come la PCR, per ottenere un risultato più accurato.

Fonti
  • Bradbury, R. S. et al. (2022). Diagnostic morphological parasitology. J. Clin. Microbiol., 60(11).
  • El-Tonsy, M. M., & Nazeer, J. T. (2024). Advances in parasitology diagnostics. Int. J. Med. Parasitol. Epidemiol. Sci.
Tecniche di analisi del DNA e di sequenziamento
06 NGS

Sequenziamento di nuova generazione

In breve

L'NGS è una tecnologia che permette di leggere contemporaneamente milioni di frammenti di DNA. In questo modo è possibile analizzare in breve tempo e a costi relativamente bassi una grande quantità di informazioni genetiche – da un singolo gene a un genoma completo.

Flusso di lavoro NGS
Rappresentazione schematica del processo di lavoro del NGS: estrazione del DNA → libreria con adattatori → sequenziamento → analisi dei dati.Fonte: MicrobeNotes, Next Generation Sequencing
Leggi l'approfondimento tecnicoNascondi i dettagli tecnici

NGS è un termine generico che indica le tecnologie che permettono di leggere il DNA e l’RNA su larga scala. A differenza dei metodi più datati, come il sequenziamento Sanger, che elaborano i frammenti uno alla volta, l’NGS legge milioni di frammenti contemporaneamente. In questo modo è possibile analizzare sia piccole regioni specifiche che interi genomi, in modo rapido e con elevata precisione.

Ci sono due approcci principali. Sequenziamento a lettura breve (ad esempio Illumina) legge brevi frammenti con un'elevata velocità di elaborazione e un basso tasso di errore – ideale per il rilevamento delle varianti e le applicazioni su larga scala. Sequenziamento a lettura lunga (ad esempio Nanopore) legge frammenti più lunghi in una sola volta, il che facilita l’assemblaggio di un genoma ed è utile per la ricerca epigenetica e le regioni ripetitive.

Il processo di lavoro: prima si isolano gli acidi nucleici e se ne controlla la qualità. Nelle analisi mirate, si procede all’amplificazione tramite PCR e all’assegnazione di un codice a barre; nel sequenziamento del genoma, il codice a barre viene aggiunto direttamente. La preparazione della libreria, l’aggiunta degli adattatori e degli indici, la purificazione e l’eventuale pooling seguono l’ordine previsto dal protocollo utilizzato. Alcuni protocolli aggiungono gli adattatori durante la frammentazione, altri mediante ligazione. La lettura vera e propria avviene nella flowcell: con Illumina i frammenti vengono immobilizzati e amplificati, mentre con Nanopore le molecole vengono fatte passare attraverso nanopori dove gli elettrodi rilevano il segnale.

Fonti
  • MicrobeNotes. Next Generation Sequencing (NGS): panoramica del processo di lavoro.
07 PCR

Reazione a catena della polimerasi

In breve

Per poter analizzare il DNA, il laboratorio ne crea prima milioni di copie con una sorta di “fotocopiatrice” biologica. Questo avviene attraverso una serie di fasi di riscaldamento e raffreddamento in cui il DNA si raddoppia continuamente. Dopo circa 30 cicli, c’è materiale a sufficienza per l’analisi, ad esempio per rilevare un’infezione.

Applicata, tra l’altro, in:
Alcuni test per le malattie sessualmente trasmissibili
Ciclo PCR
Rappresentazione schematica delle fasi di una reazione PCR: denaturazione, annealing ed elongazione.Fonte: National Library of Medicine, PCR Primer-BLAST
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La PCR amplifica (piccoli frammenti di) DNA o cDNA. Creando milioni di copie, è possibile analizzare anche quantità minime di materiale genetico. Una PCR consiste in 20-40 cicli con tre fasi che si ripetono: denaturazione, annealing ed elongazione.

Durante la denaturazione, il DNA viene riscaldato: i ponti idrogeno si rompono e i due filamenti si separano. Durante l’annealing, brevi frammenti di DNA (primer) si legano alle sequenze bersaglio e forniscono un punto di partenza alla polimerasi. Durante l’elongazione, la polimerasi allunga i primer aggiungendo nucleotidi fino a formare nuovi filamenti. Il ciclo viene ripetuto per ottenere una quantità sufficiente di DNA.

Per questo si usa un mastermix: un tampone, dNTP (i mattoncini), primer e una polimerasi termoresistente. Con i primer forward e reverse, entrambi i filamenti di DNA vengono replicati in ogni ciclo. La quantità di DNA aumenta in modo esponenziale: da un singolo frammento possono derivare un miliardo di copie dopo 30 cicli. Questo rende la PCR indispensabile nella diagnostica moderna.

Fonti
  • National Library of Medicine (2023). Reazione a catena della polimerasi (PCR). NCBI.
  • LabCE.com. Reazione a catena della polimerasi (PCR).
08 16S rRNA

Sequenziamento dell'rRNA 16S

In breve

Immagina di non leggere tutti i libri di una biblioteca, ma solo un capitolo che si trova in ogni libro. Quel capitolo è leggermente diverso da un libro all’altro, e sono proprio quelle differenze a dirti di quale libro si tratta. È così che funziona il sequenziamento del 16S rRNA: invece di analizzare tutto il DNA di tutti i batteri, questa tecnica si concentra su un unico gene presente praticamente in tutti i batteri. In base alle differenze, è possibile identificare i batteri e determinare le loro proporzioni relative.

Applicata, tra l’altro, in: analisi del microbioma intestinale (test del microbioma).
Sequenziamento degli ampliconi: dal campione al risultato
Sequenziamento mirato degli ampliconi (ad es. 16S rRNA): dal campione al risultato.Schema: elaborazione propria
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Il sequenziamento del 16S rRNA determina la diversità, la struttura e la composizione delle comunità batteriche. A differenza del sequenziamento dell’intero genoma, questo metodo si concentra su un unico gene marcatore presente in quasi tutti i batteri: il gene 16S rRNA.

Questo gene è composto da regioni conservate e ipervariabili. Le regioni conservate sono praticamente identiche in molti batteri e costituiscono il sito di legame dei primer. Le regioni ipervariabili differiscono a seconda della specie e fungono da impronta molecolare. Per il microbioma intestinale si usano spesso le regioni V3 e V4, anche se la scelta migliore dipende dall’obiettivo della ricerca e dalla piattaforma utilizzata.

Come funziona: prima si isola il DNA, poi le regioni desiderate vengono amplificate in modo selettivo tramite PCR, dopodiché gli ampliconi vengono analizzati con il sequenziamento di nuova generazione o a lettura lunga. Le sequenze vengono confrontate, tramite bioinformatica, con un database di riferimento per determinare quali batteri sono presenti e in quale proporzione relativa.

Fonti
  • Jiang, Y. et al. (2025). Species-level identification of gut microbiota (V3-V4). Frontiers in Microbiology, 16.
  • Regueira-Iglesias, A. et al. (2023). 16S rRNA gene sequencing workflow. Molecular Oral Microbiology, 38(5).
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